Defense of the Ancients là một cuộc chiến giữa hai đội chơi: một đội tên là Sentinel (Hộ Vệ) và đội kia là Scourge (Tai Họa). Căn cứ người chơi của đội Sentinel nằm ở khu vực Tây Nam của bản đồ chơi, và đội Scourge ở khu vực Đông Bắc. Mỗi khu căn cứ và các đường đi chính được bảo vệ bởi các pháo đài và các đợt quân xuất hiện theo từng đợt. Ở trung tâm của các khu căn cứ là một "Ancient", một công trình cần phải phá huỷ để giành chiến thắng chung cuộc.[4][5]

Mỗi người chơi sẽ điều khiển một hero (anh hùng, tướng), một nhân vật mạnh mẽ với các kỹ năng đặc biệt. Trong DotA, người chơi có thể chọn một trong 112 hero[6]. Mỗi hero có những kỹ năng và vai trò trong chiến thuật của trò chơi khác so với các hero khác.[7] Trò chơi được thiết kế theo hướng đồng đội cao; một người chơi riêng lẻ sẽ khó để quyết định chiến thắng cho cả đội.[8] Dù vậy, một vài hero, nếu có đủ thời gian, có thể chống đỡ được các anh hùng của đội đối phương và làm thay đổi kết quả trận đánh một mình. Defense of the Ancients cho phép tối đa 10 người chơi trong một trận đấu (5 đấu 5) và cung cấp 2 chỗ trống cho người quan sát và trọng tài hoặc khán giả. Số người chơi thường được chia đều cho hai bên.

Vì màn chơi chủ yếu xoay quanh việc tăng cường sức mạnh cho hero nên người chơi không cần quan tâm đến các việc khác như quản lý tài nguyên hay xây dựng công trình như trong các game chiến thuật thời gian thực (real-time strategy) khác. Người chơi tập trung vào việc tiêu diệt hero đối phương, các creep đối phương do máy điều khiển hoặc creep trung lập (creep rừng), phá huỷ các công trình xây dựng để có được điểm kinh nghiệm. Khi đạt được một lượng điểm kinh nghiệm nhất định, nhân vật người chơi điều khiển sẽ tăng cấp độ. Cấp độ đạt được sẽ quyết định độ dẻo dai và sức chiến đấu của hero, đồng thời người chơi có thể nâng cấp các kỹ năng đặc biệt của hero đó. Ngoài việc thu được điểm kinh nghiệm, người chơi còn thu được gold (vàng) khi giết các đơn vị máy điều khiển, kẻ địch hoặc là đánh sập các công trình của đối phương.[9] Gold sẽ được người chơi tấn công phát cuối cùng (last hit) nhận cả; vì thế nên người chơi phải phát triển một kỹ năng gọi là "last hitting", hay kỹ năng "canh hitpoint (máu) của mục tiêu thấp đủ để đánh chết chỉ trong một cú tấn công" [10]. Bên cạnh đó là kĩ năng Deny Creeps, tức là tự giết quái hoặc công trình phe mình để ngăn cản đối phương thu được vàng và kinh nghiệm. Người chơi có thể sử dụng vàng để mua các món đồ để gia tăng sức mạnh hoặc đem đến các kỹ năng đặc biệt. Nhiều món đồ có thể dùng để ghép ra món khác mạnh hơn theo các công thức nhất định. Mua đồ phù hợp với anh hùng là một yếu tố chiến thuật quan trọng để chiến thắng trong trò chơi.